牛血清白蛋白的鑒定

實驗目的：

通過牛血清清蛋白的提取與鑒定，掌握鹽析、離心、透析、電泳、及呈色反應的原理及應用。

實驗原理：

   應用相同濃度硫酸銨反復鹽析法，將血清中的清蛋白與其他球蛋白分離，再利用透析法除鹽，即可提取清蛋白。再利用電泳技術(shù)，即可對牛血清清蛋白進行分離與鑒定。

實驗步驟：

1.鹽析  取離心管一支加入牛血清待測液2 ml、加入等量PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）稀釋血清，搖勻后，逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨溶液4 ml，邊加邊搖，然后再2000 r/min離心10 min，將上清液倒入試管中，留供后面實驗用。

2.透析  去玻璃紙（15cm*15cm）一張，折成袋形，將前面*次鹽析得到的含清蛋白的上清液倒入袋內(nèi)，用線繩扎緊上口（注意要留有空隙），使透析袋下半部浸入盛有半杯蒸餾水中，對蛋白液進行透析，并用玻璃棒攪拌袋外液體，以縮短透析時間。還應經(jīng)常換水，并用納氏試劑檢查袋外液體的NH₄⁺，觀察顏色變化，直至袋內(nèi)NH₄⁺透析完畢。將袋內(nèi)液體倒入試管，既得牛血清清蛋白溶液。

3.電泳 

①.點樣 取一條2.5cm*8cm膜條，將無光澤面向下，放入培養(yǎng)皿中的巴比妥緩沖液中使膜條充分浸透，取出，用干凈濾紙吸去多余的緩沖液，以醋纖膜的無光澤面距一端1.5 cm處作為點樣線，將牛血清樣品與待測的牛血清清蛋白溶液分別用點樣器在同一張薄膜的點樣線處不同位置點樣。

②.電泳 將點樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時無光澤面（即點樣面）向下，點樣端置于陰極，待平衡5 min后，即可通電。用160伏電壓通電60分鐘，通電完畢后，用鑷子將膜條取出。

③.染色  將膜條直接浸于盛有氨基黑10B的染液中，染2 min取出，立即浸于漂洗液中，分別在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5 min，直至背景漂凈為止，用濾紙吸干薄膜。

4.鑒定  比較樣品與待測液中清蛋白在薄膜上的電泳結(jié)果，比較位置是否一致。

預期結(jié)果：如果醋纖膜上的色帶位置一致，則說明提取的清蛋白得到了純化；若在待測液的電泳結(jié)果中出現(xiàn)其他球蛋白的色帶區(qū)域，則說明清蛋白的提取不夠純。

實驗儀器：

實驗試劑：

附表：

    PBS試劑：用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.2）配制的0.9% NaCl 溶液。

    pH7.2飽和硫酸銨：用濃氨水將飽和硫酸銨溶液調(diào)到pH7.2。

    漂洗液：95%乙醇45 ml，冰醋酸5 ml，蒸餾水50 ml。

    氨基黑10B 染色液：氨基黑10B 0.5g,甲醇50 ml,冰醋酸10 ml,蒸餾水40 ml。

巴比妥緩沖液：巴比妥鈉12.76g,巴比妥1.66g，用少量蒸餾水加熱溶解后，再加水稀釋至1000 ml。

納氏試劑：溶解碘化鉀30g于蒸餾水20ml內(nèi)，再加入碘22.5g振搖使其溶解。于此碘液內(nèi)加入純汞30g，用力搖振之，待溫度升高時，將燒瓶浸于冷水內(nèi)，并繼續(xù)搖勻，直到暗棕碘色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S綠色為止。將上層溶液傾出，置于量筒內(nèi)，并以蒸餾水少許洗滌燒瓶，將洗滌液一并傾入。吸取此配成之溶液1到2滴，加入1%可溶性淀粉溶液1 ml內(nèi)，以試驗有無多余的碘存在，如不顯藍色（即無多余碘存在），可加入碘液（碘化鉀3g，碘2.5g溶于蒸餾水10 ml內(nèi)配成）數(shù)滴于配成之溶液內(nèi)，直至此液加于淀粉溶液內(nèi)初顯藍色為止；將此液以蒸餾水稀釋至200 ml，加10%氫氧化鈉溶液975 ml，混合，即成納氏試劑。試劑新配成呈現(xiàn)混濁，靜置數(shù)日，待其沉淀，再吸上清液供用。